Tên ý tưởng:

THỬ NGHIỆM MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC KHÁNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) TRONG ĐIỀU KIỆN Invitro

Tác giả NGUYỄN CHÍ NGUYỆN (ĐHTV)
Mã số giao dịch NLNN-026628
Ngày đăng 30/10/2018
Thông tin ý tưởng

1. Tính cấp thiết:

     Tôm thẻ chân trắng là đối tượng có giá trị kinh tế cao, thị trường tiêu thụ rộng, thời gian nuôi ngắn (từ 3 đến 3,5 tháng), năng suất cao (trên 4 tấn/ha) nuôi thâm canh có thể đạt đến 20 tấn/ha (Tôn Thất Chất, 2006). Nhờ có giá trị dinh dưỡng cao mà hiện nay tôm thẻ chân trắng đang được người tiêu dùng ở các thị trường lớn ưa chuộng. Mỹ là thị trường tiêu thụ tôm thẻ chân trắng lớn nhất sau đó là Châu Âu và Nhật Bản (Trần Viết Mỹ, 2009).

     Tôm thẻ chân trắng lần đầu du nhập vào Việt Nam năm 2001 và được nuôi tại nhiều địa phương như: Ninh Thuận, Bình Thuận, Phú Yên, Khánh Hòa và sau đó lan rộng ra các tỉnh ven biển như: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre, Trà Vinh (Trần Viết Mỹ, 2009). Diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng trên cả nước tính đến ngày 29/12/2017 là 99.967 ha, bằng 106,1% năm 2016. Sản lượng thu hoạch tôm thẻ chân trắng là 427.364 tấn, bằng 108,6% năm 2016 (Tổng cục Thủy sản, 2018).

Tuy nhiên, nghề nuôi tôm thẻ chân trắng ở nước ta phát triển chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế. Điều đó dẫn đến sự suy thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh (Nguyễn Đức Thành, 2005). Từ năm 2010 đến năm 2012, diện tích thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) gây ra là 7.068 ha (Bộ NN&PTNT, 2013). Năm 2013, dịch bệnh xuất hiện ở 199 xã thuộc 19 tỉnh, thành và năm 2014 dịch bệnh xuất hiện ở 233 xã thuộc 22 tỉnh, thành (Cục Thú y, 2014).

     Riêng tỉnh Trà Vinh chỉ 8 tháng đầu năm 2017 tổng số hộ nuôi tôm thẻ chân trắng là 12.804 hộ và số hộ bị thiệt hại là 2.989 hộ. Tổng diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng là 5.365 ha và diện tích bị thiệt hại là 1.123 ha nguyên nhân chủ yếu là do bệnh hoại tử gan tụy cấp gây ra (Cục Thống kê Trà Vinh, 2017). AHPND xuất hiện trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng, ảnh hưởng đặc biệt đối với tôm nuôi trong giai đoạn 20 - 30 ngày sau khi thả giống và tỷ lệ tử vong lên đến 100% (Leano và Mohan, 2012). Tác nhân gây AHPND được cho là do vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây ra (Tran và ctv, 2013).

     Do tác nhân gây AHPND là vi khuẩn nên việc lạm dụng kháng sinh trong nuôi tôm đã phổ biến thì nay lại càng trở nên thường xuyên và tràn lan. Sự lạm dụng thuốc kháng sinh và sự thiếu hiểu biết về kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nói chung đã gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe động vật nuôi, môi trường sinh thái và đặc biệt là tạo ra các chủng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh và tăng nguy cơ nhiễm khuẩn có khả năng kháng thuốc cho con người, động vật và tồn dư trong thịt động vật thủy sản (Brown, 1989). Do vậy, hiện nay hướng nghiên cứu các chất có hoạt tính kháng khuẩn nguồn gốc thảo dược được tập trung nghiên cứu nhằm tạo ra các sản phẩm sử dụng trong phòng trị bệnh mà thân thiện với môi trường và đảm bảo an toàn thực phẩm (Cos và ctv, 2006; Mahesh và ctv, 2008).

     Mặt khác, giá các loại thuốc sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ngày một tăng. Theo khuyến cáo kỹ thuật, chi phí cho một vụ nuôi trung bình khoảng 80 triệu đồng/ha và khi quá lạm dụng các loại hóa chất sẽ dẫn đến tình trạng nguồn nước, đất ở đáy ao ô nhiễm, tôm nuôi dễ phát sinh dịch bệnh (Cao Thành Trung và ctv, 2011). Từ khó khăn trên, mà hiện nay có rất nhiều các công trình nghiên cứu dùng các hợp chất thảo để điều trị bệnh trên đối tượng động vật thủy sản như: Đặng Thị Lụa và ctv (2015), Nguyễn Thị Hạnh và ctv (2015), đã thử nghiệm tác dụng kháng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ của dịch chiết hạt sim, lá sim và dịch chiết cây diệp hạ châu đắng. Khả năng kháng vibrio parahaemolyticus của cây màng tang (Litae cubela) đã được thử nghiệm trong nghiên cứu của Nguyễn Hải Vân và ctv (2015). Việc nghiên cứu dùng các hợp chất thảo để điều trị bệnh trên đối tượng động vật thủy sản không chỉ giúp nông dân giảm chi phí đầu tư, tăng thêm lợi nhuận, mà còn hạn chế việc lạm dụng các loại hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Đặc biệt là giảm khả năng kháng thuốc của vi khuẩn. Từ đó, cung cấp cho thị trường nguồn tôm nguyên liệu sạch.

     Bên cạnh đó, Nhiều báo cáo đã ghi nhận hiệu quả của các loại thảo mộc như là chất khai vị và thúc đẩy tăng trưởng trong các loài thủy sản. Theo Lee và Gao (2012), các loại thảo mộc hoạt động như là một hương vị và do đó ảnh hưởng đến sự thèm ăn như tiết dịch tiêu hóa và tăng lượng thức ăn ăn vào, đồng thời giảm FCR (Venketramalingam và ctv, 2007). (https://tepbac.com)

     Cây Thù Lù (Physalis angulata), Hành Tây (Allium cepa), cây Trứng Cá (Muntingia calabura L.) là những cây thuốc rẻ tiền khá phổ biến và đã được sử dụng trong nhân gian để điều trị bệnh trên người và cả trên đối tượng động vật thủy sản. Chúng chứa nhiều hợp chất quý trong điều trị bệnh ung thư, kháng viêm, điều hòa miễn dịch,…Đặc biệt, là chúng có khả năng kháng khuẩn cao. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào về khả năng kháng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng. Cho nên đề xuất “Thử nghiệm một số loại thảo dược kháng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong điều kiện invitro” là hướng nghiên cứu mới và cần được khai thác.

2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước:

2.1. Bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng:

2.1.1. Sơ lược về bệnh AHPND:

     Hoại tử gan tụy cấp (AHPND - Acute Hepatopancreas Necrosis Disease) hay hội chứng tôm chết sớm (EMS - Early Mortality Syndrome) gọi tắt là “bệnh gan” bắt đầu xuất hiện lần đầu tiên tại Trung Quốc (2009), Việt Nam (2010), Malaysia (2010) và Thái Lan (2012) đã gây ra những thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi tôm.

     Tại Trung Quốc, bệnh hoại tử gan tụy cấp xuất hiện lần đầu năm 2009 nhưng không được chú ý. Đến năm 2011, dịch bệnh đã lan rộng ở 4 tỉnh gồm: Quảng Đông, Quảng Tây, Phúc Kiến và Hải Nam (Leaño và Mohan, 2012). Tại Malaysia AHPND/EMS xuất hiện lần đầu vào giữa năm 2010 tại 2 bang Pahang and Joho, sau đó lan ra các bang Sabah và Sarawak (Othman, 2012). Tại Thái Lan các mẫu tôm chân trắng thu tại 2 tỉnh Chantaburi và Rayong vào cuối năm 2011 đầu năm 2012 cho thấy tôm có các dấu hiệu giống bệnh hoại tử gan tụy cấp AHPND/EMS (Prachumwat và ctv, 2012).

     Ở nước ta, bệnh hoại tử gan tụy cấp xuất hiện tại các vùng nuôi tôm ở đồng bằng sông Cửu long từ năm 2010. Năm 2011, 2012 dịch bệnh tiếp tục xảy ra, tập trung tại Trà Vinh, Sóc trăng, Kiên Giang và ở một số tỉnh ven biển phía Bắc: Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Trung bộ: Thanh Hóa, Nghệ An, Nam Trung bộ: Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận. Năm 2010 đến năm 2012, diện tích thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp là 7.068 ha (Bộ NN&PTNT, 2013). Năm 2013, dịch bệnh xuất hiện ở 199 xã thuộc 19 tỉnh, thành và năm 2014 dịch bệnh xuất hiện ở 233 xã thuộc 22 tỉnh, thành (Cục Thú y, 2014).

2.1.2. Thời gian tôm bị bệnh AHPND:

     AHPND xuất hiện trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng, ảnh hưởng đặc biệt đối với tôm nuôi trong giai đoạn 20 - 30 ngày sau khi thả giống và tỷ lệ tử vong lên đến 100% (Leano và Mohan, 2012).

     Tôm nuôi có thể chết đột ngột với tỉ lệ cao trong thời gian ngắn sau khi xuất hiện các dấu hiệu bệnh đặc biệt khoảng sau từ 2- 3 ngày (Lê Hồng Phước và ctv, 2012)

2.1.3. Nguyên nhân gây ra AHPND:

     Có ít nhất 3 chủng vi khuẩn gây bệnh AHPND trên tôm nuôi nước lợ ở Việt Nam, bao gồm 02 chủng vi khuẩn thuộc loài vibrio parahaemolyticus, đó là vibrio parahaemolyticus KC12.020 và vibrio parahaemolyticus KC13.14.2 và 01 chủng vi khuẩn non - vibrio parahaemolyticus, đó là vibrio harveyi KC13.17.5 (Đặng Thị Lụa và ctv, 2016).

2.1.4 Các triệu chứng hoặc dấu hiệu nhận biết bệnh AHPND:

     Dấu hiệu lâm sàn của tôm bị nhiễm hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính bao gồm: lờ đờ, chậm lớn, ruột rỗng (không có thức ăn), gan tụy bị teo, nhợt nhạt, chết đáy và có hiện tượng mềm vỏ (Lightner và ctv, 2012; Flegel và ctv, 2012).

     Đặc điểm mô bệnh học tôm mắc phải AHPND theo định nghĩa của Lightner và ctv (2012) và hướng dẫn nhận biết dấu AHPND (Cục Thú y, 2012) là cấu trúc mô gan tụy bị biến đổi, có hiện tượng suy giảm tế bào B, F và R, các tế gan thoái hóa rơi vào lòng ống và xuất hiện các cụm vi khuẩn trong vùng bị hoại tử.

2.5.5. Biện pháp phòng bệnh AHPND:

     Hàng ngày, kiểm tra hoạt động bơi lội của tôm (đặc biệt khi thời tiết thay đổi); quan sát hình dáng bên ngoài (màu sắc, mảng bám trên tôm, thức ăn trong ruột); nhận diện các dấu hiệu bệnh lý (nổi đầu, tấp bờ, bơi lờ đờ, dạt vào bờ, bỏ ăn, màu sắc thay đổi, mềm vỏ, đen mang) để có các biện pháp xử lý phù hợp.

      Chỉ thả nuôi tôm khi môi trường nuôi đã ổn định; cơ sở nuôi phải có ao chứa, lắng, xử lý môi trường trước khi cấp nước vào ao nuôi.

     Trong quá trình nuôi chỉ sử dụng thức ăn đảm bảo chất lượng, quản lý thức ăn đúng liều lượng; bổ sung thêm Vitamin C, khoáng chất, men tiêu hóa... đặc biệt là nhóm hỗ trợ chức năng gan, tăng cường hệ miễn dịch cho tôm.

     Quản lý các chỉ tiêu môi trường nuôi trong khoảng thích hợp (pH, độ kiềm, khí độc NH3, H2S…) và kiểm soát mật độ tảo tránh hiện tượng tảo tàn.

(Nguyễn Văn Phúc và ctv, 2013)

2.2. Vi khuẩn vibrio parahaemolyticus:

2.2.1. Hệ thống phân loại (Ackermann, 1984):

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gammaproteobacteria

Bộ: Vibrionales

Họ: Vibrionaceae

Giống: Vibrio  

Loài: Vibrio Parahaemolyticus 

2.2.2. Đặc điểm sinh vật học của vibrio parahaemolyticus:

     Vi khuẩn vibrio parahaemolyticus hình que thẳng hơi cong và ngắn. Gram âm và di động. Là vi khuẩn ưa mặn (halophile) tồn tại trong nước biển và các động vật biển như cá, tôm, sò, ốc,…Vi khuẩn vibrio parahaemolyticus mọc tốt ở môi trường kiềm và mặn. Nhiệt độ thích hợp cho sự nhân lên là 37oC và bị chết ở 65oC sau 10 phút, chúng không phát triển được ở nhiệt độ dưới 15oC. Vi khuẩn vibrio parahaemolyticus có 3 loại kháng nguyên :

+ Kháng nguyên thân 0 : chịu nhiệt, được chia thành 12 type.

+ Kháng nguyên lông H.

+ Kháng nguyên vỏ K : không chịu nhiệt, được chia thành 59 type.

(Nguyễn Trọng Nghĩa và ctv, 2014)

2.2.3. Cơ chế gây bệnh của vibrio parahaemolyticus trên tôm:

     Trong cơ chế này vibrio parahaemolyticus chỉ thực sự có được độc lực khi:

- Tích hợp được với phage tương thích.

- Tạo được các colonies có lớp biofilm bao bọc và và sinh được độc tố (toxine). Và cuối cùng tôm chết là do độc tố vi khuẩn vibrio parahaemolyticus tiết ra làm rối loạn chức năng gan tụy và hoại tử mô gan tụy.

(Sở NN&PTNT Chi cục Thú Y Đồng Nai, 2015)

2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh trên Động vật Thủy sản:

2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong tỉnh Trà Vinh:

      Việc sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh không đúng quy cách, liều lượng đang gây ảnh hưởng lớn tới sinh thái môi trường. Bên cạnh đó, việc tồn dư kháng sinh còn ảnh hưởng rất lớn tới sức khoẻ của con người. Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng thảo dược trong điều trị cho bệnh thuỷ sản đang được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh trên động vật thuỷ sản. Hơn nữa việc sử dụng thảo dược có biên độ an toàn lớn, ít ảnh hưởng tới môi trường sinh thái cũng như môi trường nuôi, đồng thời không ảnh hưởng tới sức khỏe của con người. (Nguyễn Thị Vân Thái và ctv, 2016)

      Lý Thị Út Trinh (2014) đã nghiên cứu thử nghiệm sử dụng Tỏi (Allium Stivum L) trong phòng trị bệnh xuất huyết trên cá lóc nuôi tại Trà Vinh. Kết quả cho thấy Tỏi có khả năng kháng khuẩn cao với vi khuẩn Aeromonas cho đường vòng vô khuẩn 10- 25.5mm và kháng khuẩn trung bình với Streptococcus cho đường kính vòng vô khuẩn từ 9- 12mm trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Sơn Thị Ngân (2014) đã nghiên cứu thử nghiệm tác dụng cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus niruri) lên bệnh xuất huyết trên cá lóc nuôi tại Trà Vinh. Kết quả cho thấy cây Diệp Hạ Châu không có khả năng kháng khuẩn.

      Qua các công trình nghiên cứu dùng các hợp chất thảo dược trong tỉnh Trà Vinh để hạn chế một số bệnh gây chết hàng loạt cho đối tượng nuôi thuỷ sản. Cho thấy rằng, vẫn còn rất ít các công trình nghiên cứu dùng hợp chất thảo dược để điều trị bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra. Mặt khác, cần nghiên cứu nhiều loại thảo dược khác nhau có sẳn tại từng địa phương để thuận tiện cho việc tìm kiếm thảo dược để điều trị bệnh thủy sản của các nông hộ. Từ đó, cho thấy việc tập trung nghiên cứu và ứng dụng các loại dịch chiết từ thảo dược kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) là một hướng đi đúng và đầy triển vọng.

2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài tỉnh:

     Từ thế kỷ XIV, Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mọc như tỏi, hẹ, tô mộc, hạt cải, trầu không,...để trị một số bệnh viêm nhiễm. (Đỗ Tất Lợi, 1968)

     Từ thế kỷ XX, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Ngữ (1956) trên 500 loài cây thuốc, đã khẳng định rằng nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn rất lớn. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Hưởng và ctv (1959), trên 1000 cây thuốc, chỉ ra rằng kháng sinh thực vật sử dụng rất an toàn, có tác dụng mạnh, nhóm nghiên cứu đã đưa ra chế phẩm cây tô mộc trị bệnh tiêu chảy. (Lê Hữu Thành, 2012)

Bùi Quang Tề (1985) đã nghiên cứu dùng hạt cau trị giun tròn ký sinh trong ruột cá trê (Spiritectus clariasi), liều dùng 4 gam hạt cau/kg cá/ngày, ăn liên tục trong 3 ngày và trị bệnh sán dây (Bothriocephalus gowkongensis) ký sinh trong ruột cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idellus), liều dùng 1 gam hạt cau/1 gam thức ăn, cho ăn liên tục trong 7 ngày. Bước đầu đã có kết quả tốt. (Nguyễn Đức Thành, 2005)

Ở Miền Bắc, Hà Ký (1995) và cộng sự trong chương trình 04 - 12 đã nghiên cứu một số loài thảo dược dùng để phòng trị bệnh trên cá. Bước đầu đã chọn được 9 loài cây thuốc sau: Rau nghể (Polygonum hydropiper), rau sam (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong phòng trị bệnh trên động vật thủy sản.

      Nguyễn Ngọc Phước và ctv (2007) đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu không để trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra trên đối tượng nuôi động vật thuỷ sản. Bước đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm.

      Nguyễn Thanh Hải và ctv (2013) đã nghiên cứu khả năng diệt khuẩn của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) trong 7 dung môi khác nhau (nước cất, acid acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, methanol 70%, axeton 70%, axetonitrile 70%) đối với vi khuẩn E.coli (1 chủng E.coli O44 phân lập từ phân gia cầm bị bệnh tiêu chảy; chủng E. coli Top 10 đã có plasmid kháng đơn thuốc: E.coli Top 10 pJET 1.2/blunt kháng ampicillin và E. coli Top 10 pPS1 kháng kanamycin). Kết quả cho thấy cả 7 loại dung môi đều có thể thu được dịch chiết tỏi có khả năng tiêu diệt các chủng E.coli trên. Trong đó có 3 dung môi dùng để thu dịch chiết cho kết quả diệt khuẩn đạt độ mẫn cảm cao (đường kính vòng vô khuẩn ≥ 20mm) là: axetonitrile 70%, axit axetic 5%, axeton 70%.

Huỳnh Kim Diệu và ctv (2011) đã nghiên cứu 30 mẫu chó đẻ thân xanh (CĐTX) và 30 mẫu Cỏ Mực thu thập ở nhiều tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long, được điện di protein bằng phương pháp SDS-PAGE và thử hoạt tính kháng khuẩn (xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC) trên 8 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. và Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda. Kết quả cho thấy các mẫu CĐTX và Cỏ Mực có tỉ lệ cá thể đa hình lần lượt 0,11% và 0,1%, tỉ lệ băng protein đa hình 0,4% và 0,07%, và số allele hiệu quả SENA = 2,42 và 1,52, chỉ số chỉ đa dạng về kiểu gen HEP = 0,71 và 0,6 và rõ nhất là đa dạng về kiểu hình Ho = 5,31 và 2,61. Cây CĐTX và Cỏ Mực không thuần chủng: CĐTX có 8 dòng và Cỏ Mực có 11 dòng. Hoạt tính kháng khuẩn của các dòng CĐTX và Cỏ Mực trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm không giống nhau. CĐTX chia 7 nhóm nhưng tất cả các dòng đều tác động rất mạnh trên Edwardsiella tarda (MIC= 64-512 µg/ml), kế đến Aeromonas hydrophila (MIC= 512-1024 µg/ml); các dòng Cỏ Mực đều có khả năng tác động trên các vi khuẩn thử nghiệm và có thể chia làm 3 nhóm và đều tác động mạnh trên Edwardsiella tarda (MIC= 256-512 µg/ml), kế đến Edwardsiella ictaluri (MIC= 512 µg/ml) và Aeromonas hydrophila (MIC= 256-512 µg/ml). Cỏ Mực có hoạt tính kháng khuẩn cao. Các dòng có hoạt tính cao này hy vọng sẽ là tiềm năng thay thế kháng sinh trong tương lai.

     Đặng Thị Lụa và ctv (2015) đã nghiên cứu đánh giá khả năng diệt khuẩn của dịch chiết lá sim và dịch chiết hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa) đối với các chủng vi khuẩn gây AHPND. Kết quả cho thấy cả dịch chiết lá sim và dịch chiết hạt sim đều cho kết quả kháng vi khuẩn gây AHPND trong điều kiện invitro. Tuy nhiên, dịch chiết hạt sim thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn gây AHPND cao hơn so với lá sim. Đối với dịch chiết hạt sim, đường kính vòng vô khuẩn đạt được là 17,67mm đối với chủng V. parahaemolyticus KC13.14.2; 18,0mm đối với chủng V. parahaemolyticus KC12.02.0 và 19,33mm đối với chủng vibrio sp. KC13.17.5, thể hiện khả năng kháng ba chủng vi khuẩn này của dịch chiết hạt sim gần bằng với kháng sinh Doxycylin. Dịch chiết hạt sim do đó có tiềm năng là nguồn nguyên liệu để phát triển sản phẩm thảo dược phòng trị AHPND trên tôm. Tuy nhiên, ở đây có một hạn chế là cây sim không phải tại địa phương nào cũng có. Nên việc sử dụng lá sim và hạt sim để điều trị bệnh tôm một cách rộng rãi là điều hết sức khó khăn.

      Trịnh Thị Trang và ctv (2016) đã nghiên cứu kiểm tra hiệu suất chiết lá cây trầu không (Piper betle) trong 5 loại dung môi có độ phân cực khác nhau (nước cất, methanol 80%, ethanol 96%, n -hexan và aceton 100%) đồng thời cũng đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của các cao khô dịch chiết từ lá cây trầu không đối với 2 loài vi khuẩn Aeromonas. spp và Streptococcus agalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi. Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu suất chiết xuất trong 5 loại dung môi biến đổi từ 4,00% (dung môi n-hexan) đến 19,67% (dung môi ethanol 96%). Ở nồng độ 100 mg/ml các cao khô dịch chiết đều có khả năng ức chế vi khuẩn in vitro tốt đối với 2 chủng vi khuẩn. Đối với vi khuẩn Aeromonas spp., đường kính vòng vô khuẩn bình quân giao động từ 15,00mm (dung môi nước) đến 28,00mm (với dung môi là Ethanol 96%). Đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae đường kính vòng vô khuẩn bình quân giao động từ 17,67mm (dung môi nước) đến 31,67mm (với dung môi là ethanol 96%). Nồng độ nhỏ nhất của cao khô dịch chiết lá trầu không sử dụng dung môi ethanol 96% khi bổ sung vào lỗ thạch vẫn quan sát thấy vòng vô khuẩn là 0,39 mg/ml đối với vi khuẩn Aeromonas spp. và 0,78 mg/ml đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae.

     Ở trên là các công trình nghiên cứu dùng hợp chất thảo dược để trị bệnh trên đối tượng động vật thủy sản. Tuy nhiên, vẫn còn rất ít các công trình nghiên cứu dùng hợp chất thảo dược để điều trị bệnh AHPND trên tôm thẻ chân trắng do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra.

2.7.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

       R.Koch (1887) nghiên cứu chứng minh tính kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu. Cũng trong thời gian này Chamberland chứng minh nhiều loại tinh dầu có tính kháng khuẩn, các thí nghiệm này được nhiều người như: Cadeae, Mennic, Bering, Reilling,...tiếp tục nghiên cứu. Năm 1959, Horak và Santavi chiết xuất từ cannabit sativa - Cannabinnacea, được chất cannabiriolic, dung dịch 10 - 15µg/ml có tác dụng diệt khuẩn với vi khuẩn gây bệnh lao ở người, vi khuẩn Gram (+), đặc biệt vi khuẩn kháng lại penicillin. (Nguyễn Thị Vân Thái và ctv, 2016)

       Một nghiên cứu khác của Tokin (1928) đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh như Phytocid có tác dụng với vi khuẩn, nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật rất phong phú, có phạm vi ứng dụng rất rộng rãi. (Nguyễn Văn Thanh và ctv, 2014)

       Từ củ của cây stephania cepharantha - Menispermaceae. Năm 1934 Kondo và ctv tách chiết một alcaloid có tên cepharantin, chất này có tác dụng với vi khuẩn lao ở nồng độ 10 - 20mg/ml. Năm 1934 Gupta và Kahali đã chiết suất từ cây berberis vulgaris chất berberin, chất này có ảnh hưởng tới đối với các bệnh ký sinh trùng do Leishmannia tropica, Trypanosoma equiperdum gây ra. Theo Schlederer (1962) có thể tiêm dung dịch berberin 2% trị khỏi bệnh bouton d’orient. Ukita Mizuno và Tamura (1949) nhận thấy berberin có tác dụng tốt hơn sunfathiazon đối với Staphylococcus auraus, Shigella, Gonococcus. (Nguyễn Thị Vân Thái và ctv, 2016)

     Tại thái lan, sataporn Direkbusarakom và ctv (1997) đã thử nghiệm thành công khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược như: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanthus nutans, Andrographic panniculata, Momordica  charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus, P.debelis và P.urinaria đối với vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây P.guajava và M.charantina có hiệu quả ức chế đối với Vibrio sp. Nồng độ ức chế tối thiểu của P.guajava là 0.625 mg/ml và M.charantina là 1.25 mg/ml.(Nguyễn Thị Vân Thái và ctv, 2016)

      Các kết quả trên chỉ mới bước đầu thử nghiệm sàng lọc các loại thảo dược chưa xát định được thành phần nào trong thực vật có tác dụng trên virus và vi khuẩn.

2.8. Một số loài thảo dược có tiềm năng kháng vibrio parahaemolyticus:

2.8.1. Cây trứng Cá (Muntingia calabura L.):

Bộ: Malvales

Họ: Muntingiaceae

Giống: Muntingia L.

Loài: M. calabura

       Cây trứng Cá chứa nhiều hợp chất quý như: flavonoid, steroid, saponin, tannin và triterpen (Kuntorini và ctv, 2013). Cây trứng cá thuộc họ Elaeocarpaceae, được biết đến rộng rãi cho các đặc tính sát trùng và kháng khuẩn (Shih CD và ctv, 2006). Gần đây, chiết xuất hòa tan etyl axetat của lá cây trứng cá đã được báo cáo là có tác dụng ức chế ung thư và nhiều loại bệnh khác (Su và ctv, 2003).

2.8.2. Hành Tây (Allium cepa):

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Liliopsida

Bộ: Asparagales

Họ: Alliaceae

Giống: Allium

Loài: Allium cepa

      Hành Tây là một trong những nguồn giàu chất flavonoid, organnosulphur, quercetin, myricetin, anthocyanins,.. Đặc biệt là các hợp chất lưu huỳnh là những chất dẫn xuất cysteine non- volatile, S- axit amin, S- alk (en) YL- cysteine thay thế sulphoxides, thiosulfinates và polysulfides. (Nguyễn Thị Huỳnh Mai và cộng sự, 2013. Các hợp chất này đã giúp hành tây bảo vệ và chống lại bệnh ung thư, đẩy lùi nấm và vi khuẩn, tăng cường sức khỏe tim mạch, giảm cao huyết áp và kháng insulin, hỗ trợ giảm cân, có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm phế quản mãn tính, nhiễm trùng, sốt… (Prakash và ctv, 2007).

2.8.3. Cây Thù Lù (Physalis angulata):

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Magnoliopsida

Bộ: Solanales

Họ: Solanaceae

Giống: Physalis

Loài: Physalis angulata

      Cây chứa một số hợp chất loại flavonoid như anthocyanin, alkaloid như withaminimin, withangulatin…và steroid: trong đó quan trọng nhất là các whitasteroid như physalin A-D, F, L-O, physagulin A-G, physagulid. Ngoài ra còn có chlorogenic acid, cholin, xocarpanolid, myricetin, phygrin (Đỗ Huy Bích và ctv, 2006).

     Theo Tây y, có nhiều nghiên cứu khoa học về dược tính của Thù Lù với những kết quả được công bố như sau:

- Chống ung thư

     Nghiên cứu của Chiang H.C. và ctv (1992) ghi nhận physalin F và physalin D được trích từ cây Thù Lù bằng ethanol có hoạt tính diệt tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư. Trong đó có 5 dòng loại ung thư ở người gồm : HA22T (ung thư gan - hepatoma), HeLa (ung thư cổ tử cung), KB (ung thư mũi - khí quản), Colo - 205 (ung thư ruột), Calu-1 (ung thư phổi) và 3 dòng ung thư ở động vật: H1447 (Melanoma), Hep-2 (thanh quản), 8401 glioma (não). Hoạt tính diệt tế bào ung thư mạnh nhất đối với ung thư gan và tử cung. Riêng physalin F còn có tác dụng chống u bướu loại P338 lymphocytic leukemia khi thử trên chuột.

      Các nghiên cứu tại ĐH Houston (Texas) công bố một flavonol glycosid trích từ lá Thù Lù bằng methanol: myricetin 3-o-neohesperidosid có tác dụng diệt tế bào ung thư bạch cầu chuột P-338, u biểu mô KB-16, ung thư phổi A-549 ở những nồng độ EDR50R theo thứ tự 0,048, 0,50 và 0,55 μg/ml [27]. Ngoài ra nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư gan của Thù Lù cho thấy các dịch chiết toàn cây bằng nước và bằng ethanol được đánh giá về hoạt tính chống ung thư gan trên các dòng tế bào HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5. (Shu-Jing Wu và ctv, 2004)

- Kháng khuẩn

       Nghiên cứu tại Nhật ghi nhận Thù Lù (bỏ rễ) có hoạt tính diệt được một số ký sinh trùng, đặc biệt nhất là Trypanosoma cruzi - tác nhân gây bệnh Chagas do rệp lây truyền (Nagafuji S và ctv, 2004). Ngoài ra các cao chiết bằng ether dầu, dichloromethan, methanol hoặc nước từ toàn cây Thù Lù bỏ rễ, có tác dụng rất tốt trên bệnh ngủ châu Phi ở người bị nhiễm kí sinh trùng Trypanosoma brucei rhodesiense. Cồn thuốc được chế bằng cách ngâm phần trên mặt đất của cây Thù Lù trong cồn 50% có tác dụng ức chế in vitro mạnh trên chủng lậu cầu Neisseria gonorrhoeae phân lập từ người bệnh (Đỗ Huy Bích và ctv, 2006).

3. Mục tiêu nghiên cứu:

3.1. Mục tiêu chung/tổng quát:

     Chọn lọc các loại thảo dược có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).

3.2. Mục tiêu cụ thể:

     Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch tươi và dịch chiết etanol của một số loài thảo dược lên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch.

     Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch tươi và dịch chiết etanol của một số loài thảo dược lên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.

4. Nội dung triển khai nghiên cứu:

- Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng.

- Nội dung 2: Chiết xuất các loại thảo dược từ cây Thù Lù (Physalis angulata), Hành Tây (Allium cepa), cây Trứng Cá (Muntingia calabura L.) trong việc xác định khả năng kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng.

5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

5.1. Đối tượng nghiên cứu:

     Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).

5.2. Phạm vi nghiên cứu:

      Nghiên cứu được thực hiện tại phòng vi sinh, khoa Nông nghiệp - Thủy sản, trường Đại học Trà Vinh trong 07 tháng (Từ tháng 11/2018 đến tháng 06/2019).

      Địa bàn triển khai dự kiến nghiên cứu tại huyện Cầu Ngang của tỉnh Trà Vinh.

6. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sẽ sử dụng:

6.1. Dụng cụ, môi trường và hóa chất:

6.1.1. Dụng cụ thí nghiệm:

      Bộ giải phẫu (dao, kéo, ben, kẹp gắp), pipet, đầu col, que cấy vô trùng, que trải thủy tinh, ống đong, chai môi trường, đèn cồn, đĩa petri, lamen, lame, kính hiển vi có vật kính: 10x, 20x, 40x, 100x, các ống nghiệm vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, tủ cấy, nồi hấp autoclave, máy ảnh, sổ ghi chép, búp lông, khẩu trang, cân điện tử, cốc thủy tinh, máy xay,...

6.1.2. Môi trường:

      TCBS (Thiosulphate citrate bile salt agar), BHIA (Brain Heart Infusion Agar), BHIB (Brain Heart Infusion Broth), CHROMagarTM Vibrio.

6.1.3. Hóa chất:

      Cồn 900, cồn 99.9%, nước muối sinh lý 0,85%, nước cất vô trùng, glycerol.

6.1.4. Vật liệu sinh học:

      Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).

      Các loại thảo dược: Thù Lù (Physalis angulata), Hành Tây (Allium cepa), cây Trứng Cá (Muntingia calabura L.)

6.2. Phương pháp nghiên cứu:

6.2.1. Phân lập vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng:

6.2.1.1. Thu mẫu tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp:

     Mỗi ao thu 5- 10 con tôm thẻ chân trắng bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tại 10 ao ở xã Mỹ Long Nam, huyện Cầu Ngang, Tỉnh Trà Vinh. Sau đó, ta vô trùng bề ngoài của tôm bằng cồn 700, giữ lạnh trong điều kiện (2- 80C) vận chuyển về phòng thí nghiệm không quá 12 giờ (Bộ NN&PTNT Cục Thú Y, 2012).

     Ta chọn ngẫu nhiên 5- 10 con tôm thẻ chân trắng đem đi phân lập vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.

6.2.1.2. Phân lập, nuôi cấy thuần và bảo quản vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus:

     Phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus dựa trên phương pháp nghiên cứu của Lê Xuân Phương (2015).

6.2.1.2.1. Phân lập, nuôi cấy:

     Trước khi phân lập vi khuẩn, khử trùng bề mặt ngoài của tôm bằng cồn 700 và lau sạch. Dùng pen tách bỏ phần giáp đầu ngực, khử trùng bề mặt gan tụy tôm.

     Ta nhúng đầu que cấy vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để đầu que cấy nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Dùng que cấy đã tiệt trùng lấy một ít mẫu gan tụy tôm cho vào đĩa thạch môi trường CHROMagarTM Vibrio. Kết tiếp, ta đặt que cấy vào một góc đĩa thạch. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch ria theo đường chữ T. Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.

      Các thao tác thực hiện nhanh tay và trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy vô trùng. Sau đó, đem đi ủ 24 giờ ở 370C trong tủ ấm. Sau 24 giờ, kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc mọc trên môi trường CHROMagarTM Vibrio (Vi khuẩn vibrio parahaemolyticus có màu tím hoa cà).

6.2.1.2.2. Nuôi cấy thuần:

      Ta nhúng đầu que cấy vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để đầu que cấy nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Tiếp theo, ta dùng que cấy đã tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc có màu tím hoa cà trên môi trường CHROMagarTM Vibrio cho lên bề mặt môi trường TCBS để tách ròng. Kết tiếp, ta đặt que cấy vào một góc đĩa thạch. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch ria theo đường chữ T. Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo. Sau đó, đem đi ủ 24 giờ ở 37oC trong tủ ấm. Tiếp tục, cấy chuyền khoảng 5- 6 lần trên môi trường TCBS đến khi vi khuẩn thuần.

      Sau khi vi khuẩn đã thuần. Ta đem mẫu vi khuẩn đi chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) để xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có mang gen độc lực (Nếu kết quả kiểm tra cho thấy vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus không có mang gen độc lực thì ta phải phân lập vi khuẩn lại cho đến khi mẫu vi khuẩn có mang gen độc lực).

6.2.1.2.3. Bảo quản vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong môi trường BHIB (Brain Heart Infusion Broth):

       Sau khi vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thuần và mang gen độc lực. Ta dùng petri hút 0.8ml dung dịch BHIB lỏng, 0.2ml dung dịch Glycerol và 3 khuẩn lạc vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cho vào ống type 1.5ml. Sau đó, trộn đều và giữ giống trong tủ âm 800C.

6.2.2. Chiết xuất các loại thảo dược từ cây Thù Lù (Physalis angulata), Hành Tây (Allium cepa), cây Trứng Cá (Muntingia calabura L.) trong việc xác định khả năng kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng:

6.2.2.1. Thu hái và chiết xuất thảo dược:

     Phương pháp chiết xuất thảo dược dựa trên phương pháp của Nguyễn Văn Hân và Nguyễn Việt Hương (2007).

6.2.2.1.1. Thu hái thảo dược:

     Cây thuốc thu hái vào buổi sáng (8-10 giờ), chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong ngày, được rửa sạch. (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985)

-  Cây Thù Lù (Physalis angulata). Bộ phận được lấy thử nghiệm là thân và lá 

-  Hành Tây (Allium cepa) . Bộ phận được lấy thử nghiệm là củ

- Cây Trứng Cá (Muntingia calabura L.). Bộ phận được lấy thử nghiệm là lá

6.2.2.1.2. Chiết xuất thảo dược bằng etanol:

     3 loại thảo dược tươi: Cây Thù Lù (Physalis angulata), Hành Tây (Allium cepa), cây Trứng Cá (Muntingia calabura L.) đem phơi khô, sau đó xay nhuyễn. Ngâm cồn 99.9% (tỉ lệ cồn và thảo dược là 2:1). Sau 24 giờ lọc qua giấy lọc, thu được dịch chiết sau đó ta đem đi sấy khô trong lò sấy ở nhiệt độ 1000C, thu được bột chiết thảo dược. Bột thảo dược thu được bảo quản nơi thoáng mát trong tủ 40C.

6.2.2.1.3. Chiết xuất dịch tươi:

     3 loại thảo dược tươi: Cây Thù Lù (Physalis angulata), Hành Tây (Allium cepa), cây Trứng Cá (Muntingia calabura L.) đem đi nghiền nát. Lọc lấy nước cốt. Bảo quản trong mát trong tủ 40C.

6.2.3.2. Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch tươi và dịch chiết etanol của một số loài thảo dược lên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch:

      Phương pháp này dựa trên phương pháp nghiên cứu của Schillinger và Luke (1989); Marie và ctv (2005); Mary Jane Ferraro (2009).

6.2.2.2.1. Phục hồi và xác định mật số vi khuẩn:

     Ta lấy ống type chứa vi khuẩn vibrio parahaemolyticus từ tủ âm 800C để ở nhiệt độ phòng trong 6 giờ, để rã đông. Sau đó, ta nhúng đầu que cấy vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để đầu que cấy nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Tiếp theo, ta dùng que cấy đã tiệt trùng lấy một ít mẫu vi khuẩn đã được rã đông cho lên bề mặt môi trường TCBS. Kết tiếp, ta đặt que cấy vào một góc đĩa thạch. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch ria theo đường chữ T. Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo. Đem ủ trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc.

     Sau khi phục hồi vi khuẩn. Ta dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn TCBS cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0.85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị OD = 0,1 ± 0,02. Có thể điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng cách cho thêm nước muối sinh lý (0.85% NaCl) hoặc cho thêm vi khuẩn. Khi mật số vi khuẩn đạt 108 CFU/ml thì dừng lại.

6.2.2.2.2. Chuẩn bị đĩa giếng thạch:

      Chuẩn bị 4 đĩa giếng thạch. Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vi sinh. Khi mật độ vi khuẩn đạt 108 CFU/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipet man hút 100µl vi khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch môi trường BHIA, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút tiến hành đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ đục cách nhau khoảng 20mm và khoảng cách giữa lỗ với mép đĩa petri 10-15mm. Mỗi đĩa petri (đường kính 100mm) đục tối đa 6 lỗ.

6.2.2.2.3. Thử nghiệm bằng phương pháp giếng thạch:

      Cho dung dịch thảo dược vào lỗ trong đĩa thạch. Sử dụng thảo dược bằng 2 hình thức: Dịch chiết etanol và Dịch tươi.

+ Đối với dịch tươi ta dùng pipet hút 100µl nhỏ trực tiếp vào lỗ trong đĩa thạch (mỗi loại thảo dược nhỏ vào 3 lỗ thạch). Dùng bút lông ghi chú lại tên thảo dược vào lỗ.

+ Đối với dịch chiết etanol ta đem pha loãng với nước cất tỉ lệ 1g thảo dược thì 10 ml nước cất. Sau đó, ta dùng pipet hút 100µl nhỏ vào lỗ trong đĩa thạch (mỗi loại thảo dược nhỏ vào 3 lỗ thạch). Dùng bút lông ghi chú lại tên thảo dược vào lỗ.

     Đặt đĩa thạch vào tủ ấm ở điều kiện 370C.

6.2.2.2.4. Phương pháp đọc kết quả:

      Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn.

6.2.2.3. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch tươi và dịch chiết etanol của một số loài thảo dược lên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus:

      Phương pháp này được dựa trên nghiên cứu của Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu (1985).

6.2.2.3.1. Phục hồi và xác định mật số vi khuẩn:

      Ta lấy ống type chứa vi khuẩn vibrio parahaemolyticus từ tủ âm 800C để ở nhiệt độ phòng trong 6 giờ, để rã đông. Sau đó, ta nhúng đầu que cấy vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để đầu que cấy nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Tiếp theo, ta dùng que cấy đã tiệt trùng lấy một ít mẫu vi khuẩn đã được rã đông cho lên bề mặt môi trường TCBS. Kết tiếp, ta đặt que cấy vào một góc đĩa thạch. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch ria theo đường chữ T. Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo. Đem ủ trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc.

      Sau khi phục hồi vi khuẩn. Ta dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn TCBS cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0.85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị OD = 0,1 ± 0,02. Có thể điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng cách cho thêm nước muối sinh lý (0.85% NaCl) hoặc cho thêm vi khuẩn. Khi mật số vi khuẩn đạt 108 CFU/ml thì dừng lại.

6.2.2.3.2. Phương pháp thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC):

      Tiến hành thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Dịch chiết etanol và dịch tươi.

+ Đối với dịch tươi: Thử nghiệm MIC với các nồng độ thảo dược sau: 5ppm, 10ppm, 20ppm, 40ppm, 80ppm, 160ppm, 320ppm, 640ppm, 1280ppm, 2560ppm,….40960ppm. Sau đó hút 4ml dịch huyền phù vi khuẩn ở mật độ 108 CFU/ml và 4 ml nồng độ thảo dược cho vào các ống nghiệm vô trùng. Ghi nồng độ dung dịch thảo dược và mật độ vi khuẩn vào các ống nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.

+ Đối với dịch chiết bằng etanol cũng làm tương tự: Thử nghiệm MIC với các nồng độ thảo dược sau: 5ppm, 10ppm, 20ppm, 40ppm, 80ppm, 160ppm, 320ppm, 640ppm, 1280ppm, 2560ppm,….40960ppm. Sau đó hút 4ml dịch huyền phù vi khuẩn ở mật độ 108 CFU/ml và 4 ml nồng độ thảo dược cho vào các ống nghiệm vô trùng. Ghi nồng độ dung dịch thảo dược và mật độ vi khuẩn vào các ống nghiệm. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.

      Sau 24 giờ, sau đó đem đi tráng lên môi trường BHIA.

6.2.3.3.3. Phương pháp đọc kết quả:

     Sau 24 giờ đọc kết quả bằng cách điếm mật số khuẩn lạc.

7. Đề xuất:

     Tôm thẻ là đối tượng có giá trị kinh tế, nhưng quá trình nuôi gặp vấn đề bệnh đặc biệt là bệnh AHPND, việc sử dụng hóa chất, kháng sinh sẽ làm hại môi trường. Do đó, khuynh hướng chung của thế giới và của Việt Nam nói riêng là quay về với thiên nhiên, nghiên cứu tìm ra những loài thảo dược thân thiện thay thế kháng sinh. Từ đó cho thấy việc tập trung “Thử nghiệm một số loài thảo dược kháng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong điều kiện invitro” là một hướng đi mới và đầy triển vọng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

- Bộ NN&PTNT Cục Thú Y (2012), Hướng dẫn 1128/TY-TS về thu mẫu xét nghiệm hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm nuôi (AHPNS). Cục Thú Y ban hành.

- Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2013), Hội nghị tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh trên tôm năm 2012 và triển khai kế hoạch nuôi tôm nước lợ năm 2013.

- Báo Nông nghiệp Việt Nam (2012), Buổi họp báo về tình hình dịch bệnh nuôi tôm nước lợ năm 2012, số ra ngày 30/05/2012).

- Cao Thành Trung, Nguyễn Văn Hảo Và Lê Hồng Phước (2011), Thực trạng sử dụng thuốc, hóa chất và chế phẩm sinh học trong ao nuôi thâm canh, vấn đề tôm bệnh trên diện rộng ở các mô hình trang trại ở Mỹ Thanh, Sóc Trăng.

- Châu Tài Tảo (2015), Tổng quan nuôi tôm Thẻ Chân Trắng trên thế giới và Việt Nam. Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ.

- Chi cục Thủy sản/Nuôi trồng thủy sản các tỉnh ven biển vùng Đồng bằng sông Cửu Long (2015), Báo cáo tình hình thực hiện nhiệm vụ và kế hoạch các năm trong giai đoạn 2005 - 2014.

- Cục Thú y (2012), Dấu hiệu nhận biết hội chứng hoại tử gan tụy cấp.

- Cục Thú y (2014), Tổng kết nuôi tôm nước lợ năm 2014 và xây dựng kế hoạch năm 2015. Bến Tre, ngày 4/11/2014.

- Đặng Thị Lụa, Lại Thị Ngọc Hà, Nguyễn Thanh Hải (2015), Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết lá sim và dịch chiết hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa) đối với các chủng vi khuẩn gây hội chứng gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, tập 13, số 7: 1101-1108.

- Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, Nxb Khoa học và kĩ thuật, tr. 335-341, tr. 792-793.

- Đỗ Tất Lợi (1968), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

- Hà Ký và ctv (1995), Phòng và trị bệnh cho tôm cá, Báo cáo tổng kết cấp Nhà nước mã số KN - 04 - 12, Hà Nội.

- Huỳnh Kim Diệu, Lê Thị Loan Em (2011), Đánh giá đặc tính thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của cây cỏ mực (Eclipta prostra) và cây diệp hạ châu thân xanh (Phylilanthus niuri) ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học 2011:19a 149-155 Trường Đại học Cần Thơ.

- Lê Xuân Phương (2015), Thí nghiệm vi sinh vật học.

- Lý Thị Út Trinh (2014), Thử nghiệm sử dụng Tỏi (Allium Stivum L) trong phòng trị bệnh xuất huyết trên cá lóc nuôi tại Trà Vinh. Trường đại học Trà Vinh.

- Nguyễn Đình Vương (2011), Tìm hiểu quy trình sản xuất giống tôm He Chân trắng (Penaeus vannamei Boone, 1931) tại vĩnh tân - tuy phong - bình thuận. Luận văn tốt nghiệp, trường Cao Đẳng Công nghệ Vạn Xuân.

- Nguyễn Đức Thành (2005), Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trên tôm Sú (Penaeus monodon). Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

- Nguyễn Hải Vân, Caruso Domenico, Meile JeanChristophe, Trịnh Thị Trang, Nguyễn Ngọc Tuấn, Lebrun Marc, Chu Kỳ Sơn & Sarter Samira (2015), Khả năng kháng khuẩn của cây màng tang (Litae cubela) ở Việt Nam và ảnh hưởng của tinh dầu lên đáp ứng sinh học của cá chép (Cyprinus carpio). Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3, trang 7.

- Nguyễn Ngọc Phước, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Quang Linh, Ngô Thị Hương Giang, Nguyễn Nam Quang (2007), Sử dụng thảo dược và chế phẩm từ thảo dược trong điều trị bệnh vi khuẩn cho động vật thủy sản. Kỷ yếu Khoa học Công nghệ, 2007. Liên hiệp khoa học Kỹ thuật Việt Nam Hà Nội.

- Nguyễn Thanh Hải và Bùi Thị Tho (2013), Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) đối với E.Coli kháng Ampicillin, kanamycin. Tập chí khoa học và phát triển 2013, tập 11, số 6: 804- 808.

- Nguyễn Thị Hạnh và Đặng Thị Lụa (2015), Tác dụng diệt khuẩn của cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ. Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3, trang 5.

- Nguyễn Trọng Nghĩa, Âu Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Minh Trang, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trương Quốc Phú và Phạm Anh Tuấn (2014), Phân lập và xác định khả năng gây hoại tử gan tụy của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Lớp Bệnh học thủy sản khóa 35, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.

- Nguyễn Văn Hân, Nguyễn Việt Hương, Từ Minh Koóng, Nguyễn Đình Luyện và Đỗ Hữu Nghị (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập I, NXB y học Hà Nội.

- Nguyễn Văn Phúc, Mai Thị Vân Anh, Nguyễn Thành Nhân, Nguyễn Tiến và Lê Thanh Tùng (2013), Bệnh do virus và vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh.

- Phạm Thị Ngọc Bích (2011), Tìm hiểu quy trình phát hiện vibrio trong hải sản đông lạnh. Trường Đại học Kỹ thuật công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

- Nguyễn Thị Vân Thái và ctv (2016), Bàn về tiềm năng phòng và chữa bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh thảo mộc trong nuôi trồng thủy sản.

- Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Trần Thị Phương Liên (2013), Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết từ củ hành tây (Allium Cepa L.). Tập chí khoa học số 24 - tháng 4/2013.

- Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học thành phố Hồ Chí Minh.

- Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Thanh Hải (2014), Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết cây mò hoa trắng (Clerodendron fragrans Vent.) trên vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. phân lập từ phân lợn con theo mẹ mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy và thử nghiệm điều trị. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 12(5): 683 - 689.

- Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn các tỉnh ven biển vùng Đồng bằng sông Cửu Long (2015), Báo cáo tổng kết tình hình thực hiện nhiệm vụ và phương hướng nhiệm vụ các năm trong giai đoạn 2005- 2014.

- Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Chi cục Thú Y Đồng Nai (2015), Hội chứng gan tụy cấp ở tôm.

- Sơn Thị Ngân (2014), Thử nghiệm tác dụng cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus niruri) lên bệnh xuất huyết trên cá lóc nuôi tại Trà Vinh. Trường đại học Trà Vinh.

- Tổng cục Thủy sản (2018), Hội nghị tổng kết công tác năm 2017 và triển khai nhiệm vụ năm 2018 của Đảng ủy Tổng cục Thủy sản.

- Tôn thất chất (2006), Giáo trình kỹ thuật nuôi giáp xác, trường Đại Học Nông Lâm Huế.

- Trần Viết Mỹ (2009), Cẩm nang nuôi tôm thẻ chân trắng, Sở Nông nghiệp và phát triển nông thành phố Hồ Chí Minh.

- Trịnh Thị Trang và Nguyễn Thanh Hải (2016), Tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá Trầu không (Piper betle) đối với vi khuẩn Aeromonas SPP và Streptococcus agalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi. Tập chí khoa học Việt Nam 2016, tập 14, số 6: 869- 8761.

- Lê Hồng Phước, Lê Hữu Tài và Nguyễn Văn Hảo (2012), Diễn biến của hội chứng hoại tử gan tụy trong ao nuôi tôm thâm canh ở huyện Trần Đề, Tỉnh Sóc Trăng.

- Lê Hữu Thành (2012), Thử nghiệm dịch ép lá Ổi và củ Tỏi trong phòng trị bệnh do vi khuẩn (Streptococcus spp) trên cá Trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male). Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ, trường Đại học Vinh.

Tài liệu tiếng nước ngoài

- Ackermann H.W. Kasatiya S.S. Kawata T. Koga T. Lee J.V. Mbiguino A.Newman F.S. Vieu J.-F. Zachary A (1984), Classification of Vibrio Bacteriophages, Taxonomy, Vol. 22, No. 2.

- Brown J. (1989), Antibiotics: their use and abuse in aquaculture. World Aquac., 20(2): 34 - 43.

- Buller, B.N. (2004), Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals, A Practical identification manual, CABI International Wallingford Oxfordshire OX10 8DE, UK.

- Chiang HC., Jaw SM., Chen CF., Kan WS. (1992), Antitumor agent, physalin F from Physalis angulata L., Anticancer Research, 12(3), pp. 837-843.

- Cos P., Vlietinck A.J., Berghe D.V., and Maes L. (2006), Anti-infective potential of natural products: How to develop a stronger in vitro ‘proof of concept’. J. Ethnopharmacol., 106(3): 290 - 302.

- FAO (2014), Worl aquacuture production of fish, crustaceans, molluscs, ect., by principal species in 2014. Production mondiale de I’aquaculture de poissons, crustacés, mollusques, etc.,par espèces principales en 2014. Producción mundial de acuicultura de peces, cructácéo, moluscos, etc., por especies principales en 2014. FAO yearbook annuaire anuario.

- Flegel, T.W. (2012), Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia. Journal of Invertebrate Pathology 110:166-173.

- Kuntorini, Evi Mintowati; Setya Fitriana dan Maria Dewi Astuti (2013), Struktur anatomi dan uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol daun kersen (Muntingia calabura). Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013.Semirata 2013 FMIPA Unila |29. 2013.

- Leano, E. M., và Mohan C.V. (2012), Early mortality syndrome threatens Asia’s shrimp farms. Global Aquaculture Advocate, p. 38 - 39.

- Lightner, D.V., Redman, R. M., Pantoja, C. R., Noble, B. L., Loc, T. (2012), In: M. Shariff, R.P. Subasinghe and J.R. Authur (eds.) Diseases in Asian Aquaculture 1.Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines. pp. 143155.

- Mahesh, B. và Satish S. (2008), Antimicrobial activity of some important medicinal plant against plant and human pathogens. World J Agric Sci., 4: 839 - 843.

- Marie B. Coyle et al. (2005), Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing, Library of Congress Cataloging-in-Publication Data.

- Mary Jane Ferraro (2009), Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General Principles and Contemporary Practices, 49 (11), pp. 1749-1755.

- Nagafuji S., Okabe H., Akahane H., Abe F. (2004), Trypanocidal constituents in plants 4. Withanolides from the aerial parts of Physalis angulata, Biol Pharm Bull, 27(2), pp. 193-197.

- Prakash, D., Singh, B. N., và Upadhyay, G., (2007), Antioxidant and free radical scavenging activities of phenols from onion (Allium cepa). Food Chemistry,102: 1389–1393.

- Schillinger, V. và Luke, K.K. (1989), Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol, 55, 1091 - 1096.

- Shih CD, Chen JJ, Lee HH (2006), Activation of nitric oxide signaling pathway mediates hypotensive effect of Muntingia calabura L. (Tiliaceae) leaf extract. Am J Chin Med 2006; 34:857-72.

- Shu-Jing Wu, Lean-Teik Ng, Ching-Hsein Chen, Doung-Liang Lin, Shyn-Shyan Wang, Chun-Ching Lin (2004), Antihepatoma activity of Physalis angulata and P.peruviana extracts and their effects on apoptisis in human Hep G2 cells, Life Sciences, 74(16), pp. 2061-2073.

- Su, B.N., E.J. Park, J.S. Vigo, J.G. Graham, F. Cabieses, H.H.S. Fong, J.M. Pezzuto và A.D. Kinghorn (2003), Activity-quided isolation of the chemical constituents of Muntingia calabura using a quinone reductase induction assay. Phytochemistry 63: 335–341.

- Tran, L., Nunan, L., Redman, R. M., Mohney, L. L., Pantoja, C. R., Fitzsimmons, K., và Lightner, D. V. (2013), Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Dis. Aquat. Organ, 105: 45 - 55.

Tài liệu từ các Website

- Trị Thủy (2017), Các nghiên cứu thảo mộc trong nuôi trồng thủy sản. https://tepbac.com/tin-tuc/full/Cac-nghien-cuu-thao-moc-trong-nuoi-trong-thuy-san-22402.html (Ngày truy cập: 15/09/2018).


Sau 24 giờ đọc kết quả bằng cách điếm mật số khuẩn lạc.

Đánh giá:           Lượt xem: 11892

Những Ý tưởng cùng lĩnh vực

STT Tên tác giả Ý tưởng Mã số Ngày
1 Trần Thanh Nghỉ
Lai Vung - Đồng Tháp
Nước ép chanh, cam, quýt nguyên chất. NLNN-018 20/04/2018
2 Phan Thị Khánh Phương
Thị xã Hồng Ngự - Đồng Tháp
Cơ hội có thu nhập cao NLNN-019 23/04/2018
3 Nguyễn Trường Sơn
Yên Dũng - Bắc Giang
Xây dựng mô hình hợp tác xã sản xuất Măng tây xanh theo hướng hữu cơ và xây dựng chuỗi liên kết các hợp tác xã nhằm nâng cao chất lượng và giá trị nông sản NLNN-039 31/05/2018
4 Hoàng Ninh Chi
Trường Đại học nông lâm Bắc Giang - Bắc Giang
Trồng cây dược liệu (cà gai leo) NLNN-040 31/05/2018
5 Dương Văn Cường
Hiệp Hòa - Bắc Giang
Xây dựng mô hình trồng hoa lan rừng ứng dụng công nghệ cao trong sản xuất và kinh doanh NLNN-041 31/05/2018
6 Đồng Văn Hội
Lạng Giang - Bắc Giang
Mô hình kết hợp sản xuất nấm với trồng rau sạch theo hướng hữu cơ NLNN-042 31/05/2018
7 Nguyễn Thị Hường
TP. Bắc Giang - Bắc Giang
Nghiên cứu ứng dụng một số loại phân bón sinh học sử dụng trong sản xuất rau an toàn NLNN-043 31/05/2018